PERAN ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL (EPC) UNTUK PERBAIKAN ENDOTHEL PADA ATHEROSKLEROSIS I. PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Disfungsi atau kerusakan sel endotel memainkan peranan penting terhadap proses patogenesis dari aterosklerosis dan trombosis. Perbaikan kembali fungsi endotel segera setelah terjadinya jejas pada dinding arteri merupakan langkah kunci dalam upaya menghambat perkembangan dari proses ateroslerosis dan trombosis pada pembuluh darah jantung. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa endothelial progenitor cells (EPC) yang terdapat di dalam sumsum tulang maupun beredar dalam pembuluh darah terbukti mempunyai hubungan yang kuat dengan perbaikan fungsi endotel serta proses angiogenesis neovaskularisasi pembuluh darah. Sehingga ditemukannya EPC membawa implikasi besar dalam dunia ilmiah dan kedokteran. Dengan demikian transplantasi EPC bisa menjadi suatu alternatif terapi untuk mengatasi kerusakan serta disfungsi endotel pembuluh darah. (Rainer Zbinden et all, 2007) EPC dapat diisolasidari berbagai sumber, antara lain darah tali pusat darah tepi sumsum tulang dan juga pada jaringan tubuh lainnya, seperti jaringan lemak, hati, jantung, limpa, dan saluran pencernaan. Namun jumlah EPC yang sangat terbatas dari berbagai sumber tersebut membatasi penggunaan EPC sebagai terapi alternatif. Oleh karena itu, diperlukan upaya untuk memperbanyak jumlah EPC dengan cara mengkultur secara in vitro untuk memenuh ijumlah kebutuhan dalam terapi.(J.xu at all, 2008) Bagaimana mekanisme diferensiasi EPC, dari sumber mana saja sel punca dapat berdeferensiasi menjadi EPC, serta faktor-faktor apa saja yang dapat menginduksi serta menghambat proses diferensiasi saai ini belum diketahui dengan pasti.   II. TINJAUAN PUSTAKA II.1 Endothelial Progenitor Cell (EPC) Beberapa hasil penelitian baik secara in vitro maupun in vivo memberikan bukti yang meyakinkan bahwa di dalam sumsum tulang dan aliran darah tepi terdapat sel-sel yang mampu membelah dan berdiferensiasi menjadi sel-sel endotel dan memperbaiki jaringan iskemik akibat rusaknya dinding pembuluh darah. Sel-sel ini disebut endothelial progenitor cell (EPC). Melalui eksperimen in vitro, telah diketahui tiga kelompok sel yang memiliki kemampuan neovaskularisasi, antara lain kelompok EPC yang berasal dari sumsum tulang, kelompok sel endotel dari dinding pembuluh darah yang bersikulasi di dalam darah tepi (circulating endothelial cell/CEC), serta kelompok sel yang disebut endothelial outgrowth cell (EOC), dan dua kelompok terakhir diperoleh dari hasil kultur sel-sel mononuklear darah tepi didalam medium yang sesuai. (PKY Goon et all, 2006) Secara in vivo sel-sel endotel dapat berasal HSC, common myeloid progenitor, granulocytemacrophage progenitor, dan mesenchymal stem cell. Kemungkinan sumber EPC lain adalah sel-sel monosit yang berperan dalam proses neovaskularisasi melalui mekanisme yang berbeda dari keempat sumber diatas. EPC hasil diferensiasi sel monosit tidak langsung membentuk sel endotel, tetapi bermigrasi ke perivascular space dan mensekresikan proangiogenic cytokine, seperti Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Human Growth Factor (HGF), Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), dan Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF). Secara morfologi EPC dari sel-sel monosit berbentuk spindle, menyerupai sel-sel fibroblast. Sedangkan EPC yang berasal dari sumsum tulang berbentuk seperti cobblestone, menyerupai sel endotel. (Kouros Motamed et all, 2003) II. 2 Diferensiasi Sel Punca Pada terapi regeneratif diperlikan sel punca yang telah mengalami diferensiasi menjadi sel yang lebih spesifik tanpa memandang dari mana sumbernya, kemudian baru di transplantasikan ke penderita yang memerlukan. Diferensiasi menjai sel yang lebih spesifik lainnya terjadi secar spontan jika embryonic stem cell dikultur pada media tertentu. Agar supaya aplikasi sel punca dapat berhasil dengan baik diperlukan suatu pengaturan tertentu terhadap sel punca tersebut agar dapat berdeferensiasi menjadi sel yang dikehendaki. Pengaturan terhadap deferensiasi sel termasuk diantaranya bahan kimia tertentu yang dapat menginduksi proses deferensiasi menjadi sel tertentu saat ini menjadi bahan konsep penelitian yang menarik baik secara in vitro maupun secara in vivo. (FAN Chun-Ling et all, 2003) Growth factor terbukti dapat menginduksi suatu proses deferensiasi dan dalam proses deferensiasi sel, gen tertetu akan teraktifasi dan dilain pihak gen yang lain akan mengalami inaktifasi. Dalam proses diferensiasi akan terjadi perubahan-perubahan seperti fisiologi sel, ukuran, bentuk serta aktifitas metabolik, respon terhadap stimulus serta ekspresi gen, dan sebagai hasil akhir dari proses deferensiasi akan terbentuk sel yang spesifik dan mempunyai fungsi tertentu. (at all, 2009) Berdasarkan kemampuan berdiferensiasi, sel punca dibagi menjadi : 1. Totipotent. Dapat berdiferensiasi menjadi semua jenis sel. Yang termasuk dalam sel puncatotipotent adalah zigot (telur yang telah dbuahi). 2. Pluripotent. Dapat berdiferensiasi menjadi 3 lapisan germinal : ektoderm, mesoderm, endoderm, tapi tidak dapat menjadi jaringan ekstraembryonik seperti plasenta dan tali pusat. Yang termasuk sel puncapluripotent adalah embryonic stem cells. 3. Multipotent. Dapat berdiferensiasi menjadi banyak jenis sel. Misalnya : hematopoietic stem cells. 4. Unipotent. Hanya dapat menghasilkan 1 jenis sel. Tapi berbeda dengan yang lainnya, sel puncaunipoten mempunyai sifat dapat memperbaharui atau meregenerasi diri (self-regenerate/self-renew) Sel punca hematopoetik dalam perkembangannya dapat menghasilkan sel-sel darah. Sel tipe hematopoetik merupakan tipe sel punca yang sejak lama telah digunakan dalam terapi keganasan darah (leukimia). Strategi terapi ini memungkinkan dilakukannya kemoterapi dosis tinggi yang dapat mengeliminasi sel abnormal (ablasi) pada penderita keganasan. Populasi sel yang ‘tereliminasi’ oleh kemoterapi akan digantikan oleh sel punca hematopoetik yang ditransplanstasikan. Namun perlu diperhatikan bahwa selama populasi sel belum tergantikan, pasien berada dalam kondisi yang sangat rentan untuk terkena infeksi sehingga diperlukan perawatan di fasilitas isolasi yang dapat menjamin kondisi yang aseptik. Saat ini fasilitas ruang isolasi masih jarang dimiliki oleh rumah sakit di Indonesia dan hal ini seringkali membuat biaya transplantasi sel punca menjadi sangat tinggi.(PKY Goon et all, 2006) Sel punca hematopoetik memiliki molekul yang khas pada permukaan selnya, yaitu molekul glikoprotein CD34+.Molekul penanda ini dapat digunakan sebagai sarana untuk menghitung jumlah sel punca hematopoetik yang berhasil diisolasi dari berbagai sumber di atas. Bahkan dalam penggunaannya dalam terapi keganasan, telah ditentukan jumlah CD34+ yang direkomendasikan oleh ASBMT (American Society for Blood and Marrow Transplatation) dan ISCT (International Society for Cellular Therapy) bahwa untuk meningkatkan angka keberhasilan engraftment dari sel yang ditransplantasikan diperlukan setidaknya 5 x 106CD34+ cells/kg berat badan. Oleh karena itu, fasilitas laboratorium terpercaya yang dapat menghitung jumlah sel CD34+ (CD34 enumeration) menjadi mutlak diperlukan untuk trans plantasi jenis ini. Beberapa tahun terakhir, dilaporkan bahwa + 80% dari sel punca CD34+ juga mengekspresikan penanda CD133. Sel dalam populasi CD34+/CD133+ dikenal dengan sebutan hemangioblast yang dalam perkembangannya dapat berdiferensiasi menjadi turunan sel hematopoetik (heme) dan sel endotel (angio). Hemangiblast pertama kali diekstraksi dari embryonic culture yang dimanipulasi dengan cytokine untuk di deferensiasi menjadi sel hemapoetik atau sel endotel dan temyata hemangioblast juga dapat ditemukan pada jaringan pada individu yang telah berkembang secara sempuma seperti pada bayi bahkan hemangioblast dapat ditemukan sebagai sel punca pada aliran darah tepi pada individu dewasa dan sumsum tulang. Hal ini dipertegas dengan temuan Asahara et al yang melaporkan bahwa populasi sel tersebut merupakan sel tipe Endothelial Progenitor Cell/ EPC. Lebih lanjut, EPC merupakan sel progenitor yang bertugas meregenerasikan sel endotel dalam pembuluh darah, Oleh karena itu, jumlah EPC dalam sirkulasi peredaran darah dilaporkan mengindikasikan besamya risiko terjadinya artherosklerosis maupun kejadian kardiovaskular mayor. (Hideki Kobayashi et all, 201) 11.2.1 Peranan Signal Tranduction pada diferensiasi sel Signal transduction adalah suatu proses yang di awali oleh aktifasi reseptor yang berada di membran (Transmembrane receptor)o\eh sinyal molekul dari luar sel, yang pada akhirnya akan mengakibatkan molekul didalam sel mengeluarkan suatu .respon tertentu. Transmembrane receptor terbentang pada membran sel dimana sebagian reseptor berada di luar dan sebagian berada di dalam sel, sinyal mengikat bagian reseptor yang berada diluar sel merubah bentuknya dan menghantarkan sinyal ke dalam sel. Beberapa molekul sinyal seperti testosteron dapat melewati membran sel dan mengikat secara langsung reseptor yang berada di dalam sitoplasma maupun di nukleus. Di lain fihak ada juga kaskade penghantaran sinyal di dalam sel, dimana setiap tahap dari kaskade, sinyal akan mengalami amplifikasi, jadi pada proses signal transduction, sinyal molekul yang kecil dari luar sel akan dapat menghasilkan respon yang besar dan diharapkansinyal yang lebih besar dapat menghasilkan perubahan pada sel baik melalui ekspresi dari DNA atau melalui aktifitas enzym di dalam sitoplasma. Proses tersebut dapat dalam milidetik melalui ion flux, beberapa menit untuk protein atau lipid yang dimediasi oleh kaskade kinase, beberapa jam bahkan hari jika melalui ekspresi gen.(Dhillon AS et all, 2007) 11.2.1.1 Signaling molecules Kebanyakan signal transduction melibatkan ikatan dari signaling molecules diluar sel dengan reseptor di permukaan sel yang secara khas akan menghadap keluar sel. Kaskade penghantaran sinyal di dalam sel juga dapat di picu tanpa melalui reseptor di membran oleh karena sifat lipofilik dan hidrofobik. Beberapa hormon steroid mempunyai reseptor di dalam sitoplasma dan bekerja dengan cara mengikat reseptor pada promoter region dari steroid-responsive genes. Pada organisma multiselular beberapa molekul kecil dan polipeptida mengkoordinasi sel melalui aktivitas biologi secara individual, berdasarkan fungsinya molekul-molekul tersebut di klasifikasikan sebagai berikut: • hormones (melatonin) • growth factors (epidermal growth factor) • extra-cellular matrix components (fibronectin) • cytokines (interferon-gamma) • chemokines ( RANTES) • neurotransmitters (acetylcholine) • neurotrophins ( nerve growth factor) • reactive oxygen species and other electronically-activated compounds 11.2.1.2 Respon seluler Aktifitas gen, perubahan metabolisme, sel menjadi proliferasi atau mati, stimulasi atau supresi, merupakan respon sel terhadap stimulasi dari luar sel yang memeriukan signal transduction. Faktor-faktor transkripsi yang dihasilkan dari kaskade signal transduction dapat mengaktifsi beberapa gen, oleh sebab itu adanya stimulus awal dapat memicu ekspresi dari keseluruhan kelompok gen yang pada akhimya dapat mengaktivasi beberapa kondisi fisilogis yang kompleks, termasuk diantaranya peningkatan ambilan glukosa dari sirkulasi darah oleh insulin, migrasi dari neutrofil ke tempat infeksi yang di stimulasi oleh produk dari bakteri, hal tersebut yang dikenal sebagai program genetik. Sebagian besar sel mamalia memeriukan stimulus untuk mengontrol tidak hanya pembelahan sel tapi juga untuk mempertahankan hidup. Tidak adanya stimulus growth factor sel-sel akan mengalami apoptosis secara keseluruhan, untuk itu signal transduction pathway merupakan pengendali utama proses biologi sel dan beberapa penyakit terjadi akibat dari gangguan regulasi dari signal transduction pathway ini. (Roberts PJet all, 2010) 11.2.1.3 Tipe reseptor Reseptor dapat di bagi menjadi dua tipe: 1. Cell-surface receptors. 2. Intracellular receptors Ligand-gated ion channel receptors adalah reseptor yang dapat di temukan pada permukaan sel atau di dalam sel. Ligan yang hanya berikatan dengan reseptor intracellular termasuk diantaranya steroid hormones, thyroid hormone, retinoic acid, dan derivat dari vitamin D3. Di lain pihak ligan yang berikatan dengan reseptor di permukaaan sel untuk menginisiasi signal tmsduction harus melewati membran sel. 11.2.1.3.1 Cell-Surface Receptors Reseptor pada permukaan sel merupakan bagian dari protein transmembran dan yang dapat dikenal oleh molekul sinyal dari luar sel. Reseptor tersebut terbentang pada membran plasma dengan satu bagian berada diluar sel dan yang lainnya berada di dalam sel (the intracellular domain). Signal tranduction dapat terjadi sebagai hasil dari stimulasi molekul atau ligan pada ekstraselluler domain, dan ligan tidak dapat melewati membran plasma tanda mengikat reseptor terlebih dahulu. Ikatan antara ligan dan reseptor pada permukaan sel menstimulasi serial kejadian di dalam sel, dimana berbeda tipe reseptor akan memberikan respon yang berbeda pula. Reseptor secara spesifik akan mengikat ligan tertentu kemudian ligan akan mengawali transmisi sinyal melewati membran plasma dengan cara merubah bentuk atau menyesuaikan diri sesuai dengan model molekul tertentu, yang kemudian akan menghasilkan aktifitas enzymatik atau membuka ikatan untuk protein sinyal yang lain di dalam sel. Sekali protein berikatan dengan reseptor kemudian akan menjadi aktif dan menghantarkan sinyal kedalam sitoplasma. Padasel eukaryotic sebagian besar protein intraseluler yang diaktifkan oleh ikatan ligan dan reseptor mempunyai aktifitas enzymatik, enzym tersebut ternasuk tyrosine kinase G protein, small GTP ase, serine/threonine protein kinase, phospatase, lipid kinase dan hydrolases. Beberapa camp serta cGMP PIP, DAG dan IP3, IP3 mengatur pengeluaran kalsium intraseluler yang di keluarkan ke sitoplasma. Protein lain berinteraksi dengan adapter protein, adapter protein memfasilitasi interaksi diantara protein sinyal dan mengatur pembentukan komplek sinyal yang dipertukan untuk menghasilkan respon seluler yang memadai. Ada beberapa klas dari reseptor transmembran yang dapat mengenali molekul sinyal ekstra seluler yang berbeda diantaranya adalah: 1. Receptor tyrosine kinases 2. Integrins 3. G-protein coupled receptors 4. Toll-like receptors 11.2.1.3.2 Receptor Tyrosine Kinases Receptor tyrosine kinases (RTKs) adalah protein transmembran yang mempunyai domain intraseluler dan domain ekstraseluler yang mengikat ligan. Ada beberapa protein RTK yang di klasifikasikan dalam subfamili tergantung dari struktur yang di miliki serta ligan spesifik, termasuk diantaranya resptor growth factor, seperti reseptor insulin dan insulin-like receptor, untuk mengatur sinyal biokimianya RTK membentuk dimers di dalam membran yang di stabilisasi oleh ikatan ligan dan reseptor, kemudian interaksi antara kedua dimmer pada domain sitoplasma akan menstimulasi autophosporilation dari tyrosine yang ada pada domain tyrosine kinase sitoplasma dari RTK yang akhimya dapat menyebabkan perubahan konformasi. Domain kinase dari reseptor kemudian teraktifasi mengawali kaskade phosporilasi dari molekul sitoplasma, dan sinyal tersebut diperlukan untuk beberapa proses seluler seperti mengontrol pertumbuhan sel, diferensiasi, migrasi serta metabolisma dari sel. Small G protein yang terdiri dari Ras, Rho, Raf merupakan Protein yang dapat mengikat GTP, protein ini mempunyai peran penting dalam transmisi sinyal dari RTK ke dalam selyang bertindak sebagai molecular switcher yang biasanya terikat pada membran melalui gugus carboxyl dari grup isoprenyl, dan selama aktifasi mereka bertanggung jawab dalam rekruitmen protein pada subdomain membran yang spesifik yang berperan pada penghantaran sinyal. RTKs yang aktif kembali mengaktifkan small G protein kemudian mengaktifkan Guanine Nucleotide Exchange Factors seperti SOSLDan sekali aktif faktor pengubah tersebut dapat mengaktifkan small G protein lebih banyak lagi yang akhimya dapat memperbesar sinyal awal. Jika terjadi mutasi pada mutasi pada gentertentu dari RTK dapat menghasilkan ekspresi reseptor dalam keadaan akti terus menerus, dan bersifat onkogenik. Integrins